AULA PRÁTICA: TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( ANTIBIOGRAMA )

    UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

CURSO DE ENFERMAGEM

Disciplina: MICROBIOLOGIA Prof. Dr. Luis Carlos F. Carvalho

PRÁTICA: TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

( ANTIBIOGRAMA )

Objetivos: Determinar a susceptibilidade de microrganismos a diferentes antibióticos por meio da técnica de difusão em ágar. Interpretar um antibiograma em função do diâmetro do halo de inibição de diferentes antibióticos.

Princípio: Os antibióticos impregnados nos discos, difundem no ágar e formam um halo de inibição ao seuredor quando encontram bactérias sensíveis. A bactérias resistentes crescem próximo ao disco, não ocorrendo a formação de halo.

Material: Placas contendo ágar Mueller-Hinton, Microrganismo isolado em cultura pura (E.coli ou S.aureus) e suspenso em salina (inóculo)

Metodo:

Preparo do inóculo: Tomar 4 a 6 colônias do cultivo puro e inocular em um tubo com caldo BHI. Incubar o tubo por 2 a 5 horas até obter uma suspensão com turvação moderada. O inóculo deve ser adequadamente padronizado, pois caso contrário o resultado do antibiograma poderá ser alterado significativamente. Preparar as diluições de cada cultura em solução salina fisiológica até que a turbidez das suspensões ajustem-se a 108 bactérias/ml. Comparar as suspensões contra um padrão de turvação (0,5ml de BaCl2.2H2O 0,048M em 99,5ml de H2SO4 0,36N) preparado mensalmente.

Semeadura: Utilizar um “swab” estéril para cada cultura, imergindo-o no “inóculo” . Esgotar o excesso delíquido, apertando o “swab” contra a parede do tubo e semear cada microrganismo em ágar Mueller-Hinton em diferentes sentidos, assegurando uma semeadura uniforme.

Aplicação dos discos: Mantendo sempre a assepsia, depositar com uma pinça estéril (imersa no álcool ou flambada na chama) os discos de antibióticos indicados sobre a superfície do inóculo em placa de ágar. Em seguida, com pinça estéril, exercer uma leve pressão sobre cada disco, para se obter uma boa aderência, a fim de permitir um contato do disco com a superfície do ágar. Caso contrário, poderá ocorrer erros na leitura dos resultados, devido a difusão não uniforme do antibiótico no ágar. Não se deve colocar mais de 9 discos por placas de 100mm, assim como, é muito importante levar em conta a distância entre eles.

Incubação: Depois de trinta minutos, as placas devem ser incubadas invertidas a 37oC durante 16 a 18 horas.

Leitura: Observar e medir o halo de inibição, comparando com a tabela em anexo para determinar a

susceptibilidade aos antibióticos: S (Sensível), R (Resistente) e I (Intermediário)

Interpretação:

A interpretação dos resultados do antibiograma pelo método dos discos de concentração única é

baseada na correlação existente entre os parâmetros seguintes, verificados com relação a diferentes cepas bacterianas:

a) Concentração mínima inibitória (C.M.I.) - dose mínima de antibiótico que, adicionada ao meio de cultura

(líquido ou sólido), é capaz de inibir totalmente o crescimento de um inoculum estândar.

b) Zona de inibição ( Z.I.) - diâmetro do halo estéril em torno do disco, em placas semeadas com as mesmas cepas bacterianas.

A observação clínica permitiu estabelecer, ademais, os valores de C.M.I. correspondentes ao sucesso terapêutico, de sorte que é possível inferir, pelo valor de Z.I., qual o antibiótico de escolha para a cepa bacteriana em questão.

Zonas de Inibição (em mm) correspondentes a diferentes graus de Suscetibilidade*

ANTIBIÓTICO OU R I S

QUIMIOTERÁPICO

• Ac . nalidíxico 13 14-18 19

• Ampicilina 11 12-13 14

• Cefalotina 14 15-17 18

• Cloranfenicol 12 13-17 18

• Eritromicina 13 14-17 18

• Estreptomicina 11 12-14 15

• Gentamicina 12 - 13

• Kanamicina 13 14-17 18

• Neomicina 12 13-16 17

• Nitrofurantoína 14 15-18 19

• Penicilina G 20 21-28 29

• Polimixina B 8 9-11 12

• Tetraciclina 14 15-18 19

• Trimetoprim 10 11-15 16

• Vancomicina 9 10-11 12

*R – Resistente; S – Sensível; I – Intermediária

Comentários

Discos utilizados no teste:

O método estândar recomendado pela “Food and Drug Administration” dos Estados Unidos utiliza

discos de concentração única, que devem ser conservados ao abrigo da umidade (dessecadores) e em

temperatura baixa (3oC ou - 14oC, conforme o caso). Utilizam-se discos de concentração única e adequada,

para cada antibiótico, à obtenção de halos de inibição indicadores do grau de sensibilidade de diferentes

bactérias: penicilina (P), bacitracina (B) – 10UI.; ampicilina (A), colistina (C), estreptomicina (S), gentamicina

(G), rifampicina (R), viomicina (VI) - 10 mcg; eritromicina (E), oleandomicina (OL) - 15 mcg; cefalotina

(CE), cloranfenicol (CL), declomicina (D), gabromicina (GB), kanamicina (K), a. nalidíxico (NA), neomicina

(N), novobiocina (NO), rovamicina (RO), tetraciclina (T), vancomicina (V) - 30 mcg; sulfas em geral,

furadantina (F) - 300 mcg, etc.

Multidiscos são oferecidos em numerosas combinações, para atender a diferentes objetivos:

infecções urinárias, feridas supuradas, etc.

Antibiograma- Métodos Convencionais

Uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia clínica é avaliar a sensibilidade de

microrganismos a antimicrobianos. O objetivo dos testes que fazem esta avaliação é prever, através da

realização de provas “in vitro”, a probabilidade de sucesso terapêutico no uso das drogas avaliadas no

tratamento de infecções causadas pelo microrganismo a ser testado.

O desenvolvimento de novos e variados mecanismos de resistência pelos microrganismos tem gerado

o surgimento de um número cada vez maior de antimicrobianos. Esses dois fatores tem levados à necessidade

de aprimoramento constante dos testes de sensibilidade a antimicrobianos. Existem varias opções para

avaliação de sensibilidade a antimicrobianos, tais como disco-difusão, microdiluição em caldo, métodos

rápidos automatizados e, mais recentemente, o E test, que é um teste comercial baseado no método de difusão

em ágar.

O método de disco-difusão é o mais utilizado no Brasil e na maioria dos países. Esse teste é realizado

através da aplicação de um pequeno disco de papel de filtro impregnado com antimicrobiano a superfície do

ágar onde o microrganismo foi inoculado. A difusão do antimicrobiano no ágar levará a formação de um halo

de inibição de crescimento. Através da medida do diâmetro desse halo o microrganismo será classificado em

resistente (R), intermediário (I) ou sensível (S). É um método bastante simples, fácil de ser realizado e que

possui acurácia excelente quando realizado de maneira adequada.

Em resumo, a terapêutica antimicrobiana de infecções causadas por algumas bactérias, fungos, vírus e

parasitas continua a ser empírica porque ainda não foram detectados problemas de resistência, ou por falta de

alternativas terapêuticas. O rápido aumento na prevalência de infecções causadas por microrganismos

resistentes, porém, tem exigido não somente o aprimoramento das técnicas laboratoriais como também o maior

conhecimento destas por parte do médico assistente. Este deve reconhecer as situações onde os diferentes testes estão indicados e saber interpretar os resultados fornecidos.

Resumo da Prática:

TSA - Teste de susceptibilidade aos antibiogramas:

- Suspensão de bactérias em solução de soro fisiológico;

- Depois da suspensão de bactérias semeia por espalhamento;

- Depositar os discos de antibióticos;

- No centro da placa, coloca o continente cortado e em cima pinga o antibiótico no cotonete e coloca na estufa (incubar de 37C / 24-48h).

Antibacterianos: 

Cefalozina sódica (colocado no cotonete) 

Norfloxacin 

Amicacina 

Penicilina 

Meropenem 

Pontos que apresentarem halos de inibição significa que a bactéria é sensível ao antibiótico. Se não apresentar, ela é resistente.