Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica, etc.,) e estabeleceu, a partir daí, uma metodologia de coloração diferencial.

Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem contudo, afetar substancialmente a ideia original.

Os microrganismos respondem diferentemente ao método. Há os que retém o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos, com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro (Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta; enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o contra-corante, tornando-as vermelhas.

A parede celular bacteriana apresenta particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de peptidoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontado como fator determinante da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptideoglicano da parede celular, numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonuclease de magnésio é mediadora da fixação do corante.

A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como Gram-variável, pela perda da capacidade de retenção do corante.

A coloração é hoje empregada com elevado significação taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos peritríquios ou polares, e todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.

Questões

1. A coloração de Gram possibilita caracterizar as bactérias quanto ao comportamento tintorial (Grampositiva e Gram-negativa), morfologia (cocos, bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos pares). Qual o significado destas informações para a medicina?

R: São necessárias para identificar o diagnóstico e tratamento das doenças infecciosas.

2. A coloração de Gram exerce alguma importância em diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de infecções humanas e animais? Citar pelo menos um exemplo.

R: Sim, porque a A coloração de Gram pode prever o tipo de bactéria que causa uma infecção, como pneumonia pneumocócica ou abscesso estafilocócico.

3. Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a aplicação dos corantes que integram a metodologia. Comentar os resultados possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida no método.

R: Esquecer de descorar com alcool-acetona: As bactérias Gram-negativas serão observadas de cor roxa (violeta);

4. Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação, para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.

5. Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como esta reação pode ser empregada para a verificação do estado de pureza de uma determinada cultura?

R: A realização periódica do exame de uma cultura pura demonstra que todas as colônias apresentam a mesma característica morfo-tintorial.

6. Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.

R: A penicilina agem sobre a parede celular, causando ruptura e consequentemente altera todas as características morfotintoriais observada na coloração de Gram.

7. Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso não é verdadeiro".

R: A característica tintorial de Gram-negativa é devido a presença da membrana externa, que pode ser perdida em certas condições de cultivo desfavorável, fazendo com que a bactéria apresente característica de Gram-positiva (roxa), mas o contrário não é possível porque uma bactéria Gram-positiva jamais adquire a membrana externa, ou seja, uma vez, Gram-positiva, sempre Gram-positiva.

PRÁTICA - COLORAÇÃO DE ZIEHL NEESEN

Objetivo: Elaborar uma coloração para identificar os Bacilos Álcool-Ácido-Resistentes (BAAR) em material biológico, essencial no diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas causadas por micobactérias, tais como tuberculose e Hanseníase.

Princípio: Existem bactérias que são resistentes à coloração, porém quando coradas, resistem fortemente à descoloração, mesmo quando submetidas a ácidos fortemente diluídos e ao álcool absoluto, sendo assim denominadas de bacilos álcool-ácido-resistentes (BAAR). A característica álcool-ácido-resistente é conferida a essas bactérias devido ao alto teor de lipídeos estruturais na parede celular, que causa uma grande hidrofobicidade, que dificulta a ação de corantes aquosos. Um exemplo de ácido graxo altamente presente na parede celular dessas bactérias é o ácido micólico. Na técnica de Ziehl-Neelsen, após o processo de coloração da amostra, a fucsina de Ziehl irá corar todos os elementos celulares de vermelho, porém após a descoloração com o álcool, somente os bacilos álcool-ácidos-resistente irão continuar preservando a cor vermelha, os demais elementos celulares na amostra serão descoradas. Então, para podermos visualizar os outros elementos celulares (descorados) na amostra, deve-se utilizar azul de metileno, que dará um contraste, deixando os elementos celulares em azul e os bacilos álcool-ácidos-resistentes continuarão em vermelho.

Material: Laminas, swab estéril, solução de fucsina fenicada, solução de azul de metileno, solução de HCl a 5% em ácool, lamparina à álcool, fósforo, álcool comercial

Método:

▪ Fixar a lâmina com o calor;

▪ Cobrir o esfregaço com fucsina fenicada;

▪ Aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos;

▪ Lavar suavemente a lâmina em água;

▪ Colocar álcool-ácido clorídrico, até que o corante não se desprenda mais (cerca de dois minutos);

▪ Lavar a lâmina com água;

▪ Cobrir o esfregaço com azul-de-metileno (durante trinta segundos);

▪ Lavar a lâmina com água;

▪ Deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão

PREPARAÇÃO DOS CORANTES

Corantes de Ziehl – Neelsen

Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen:

Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro. Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima.

Observação: Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tomar-se-ão 5,75 ml ao invés de 5 ml.

Álcool-Ácido:

Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente.

Observação:

Alguns autores recomendam Álcool-Ácido à 1%.

Azul de metileno:

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar Água destilada ou deionizada até completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro.

PRÁTICA - COLORAÇÃO SIMPLES

Princípio: A coloração simples tem bases físico-químicas. A impregnação de uma célula por um corante pode ser entendida a partir de fenômenos como a capilaridade, osmose, adsorsão e absorção. Mas, é sobretudo pela compreensão de certas reações de corantes de organóides, inclusões e estruturas celulares que se firmam as bases desta metodologia. Desta forma é observada uma reação estequiométrica entre corantes e uma dada estrutura, por força da afinidade de suas cargas opostas. Normalmente o que é uma reação de dupla troca de cátions e anions, do tipo:

(Microrganismos)- (Na+ , K+ , etc) + (cromóforos) → (microrganismo)- (cromóforos) + + (Na+ K+ , etc. ) + (Cl- , oxalato, etc) Material: Material biológico2 em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou contagotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc)

Material: Material biológico em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou contagotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc)

Método: Fazer um esfregaço com o material biológico. Esperar secar. Fixar ao calor . Cobrir o esfregaço com o corante. Esperar por 1 a 5 min. Lavar com água, secar o observar ao microscópico com objetiva de imersão.

Interpretação: Anotar as suas observações, tais como presença de células, afinidade pelo corante, forma e disposição dos microrganismos, etc.

Comentários: Sob o ponto de vista químico, os corantes são substâncias orgânicas possuidoras de grupamentos cromóforos que podem conferir aos corpos celulares uma dada pigmentação. Os corantes são classificados em três grupos, de acordo com a carga do íon da porção corante da molécula. Assim, são corantes ácidos os que têm uma carga negativa; básicos os que tem cargas positivas e neutros os que são, portanto, eletricamente neutro.

Em bacteriologia, os corantes básicos são os mais empregados. Isto justifica-se pela presença de cargas elétricas, negativas, ao longo do corpo celular, o que demonstra a afinidade por este tipo de corantes.

Iniciamos o processo de coloração simples realizando um esfregaço de cera de ouvido, com o auxílio de cotonete, na lâmina.

Com o auxílio de um prendedor de roupa, pegamos a lâmina com o material biológico e o aquecemos com uma vela acesa.

Após isso, cobrimos o material com o corante azul metileno, e aguardamos 5 min.

Lavamos levemente a lâmina com água e esperamos secar.

O corante facilitou a visualização do material, por meio do microscópio, deixando em evidência as estruturas de micro-organismos que não eram possíveis visualizar apenas aplicando na lâmina.

Questões:

1. Os meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influência na morfologia de células em coloração simples?

R: O meio de cultura é uma preparação muito utilizada em laboratórios, que tem por objetivo fornecer aos micro-organismos o local perfeito para o seu crescimento. A idade de colônia é uma unidade de medida usada para estimar o número de bactérias ou fungos viáveis - isto é, capazes de se multiplicar mediante fissão binária sob condições controladas - de uma amostra. O objetivo básico da coloração simples é mostrar toda a estrutura do microrganismo incluindo a forma e as estruturas básicas.

De forma resumida, a coloração simples, por afinidade a alguns componentes de determinadas bactérias, permitirá a melhor visualização destas. Porém há informações e preparos que devem ser feitos para que a coloração seja realizada de maneira correta, como os que são citados no enunciado.

2. A coloração simples se presta a identificação de uma cultura mista de microrganismos? Que observações poderiam ser obtidas?

R: O objetivo é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. É mais frequentemente usada na verificação das características morfológicas das bactérias. Apresenta vantagens como: células mais facilmente visíveis após coloração, podem ser evidenciadas diferenças entre células de diferentes espécies ou dentro da mesma espécie pelo uso de soluções corantes apropriadas.

3. Qual a aplicação da coloração simples no Diagnóstico Laboratorial de doenças infecciosas?

R: As bactérias, que podem causar doenças infecciosas, são praticamente incolores, não apresentando contraste suficiente, o que dificulta sua visualização. A diferença química entra as bactérias e o meio é que nos permite distingui-las por técnicas de coloração. O exame microscópico do tecido pode ser necessário para distinguir doença invasiva de colonização de superfície. A distinção não é facilmente alcançada por métodos de cultura.

4. Cite exemplos de Doenças Infecciosas e seu agente infecioso que são diagnosticados seguramente por uma coloração simples?

R: Parasitas no sangue; Histoplasma capsulatum nos fagócitos e nas células teciduais; Inclusões intracelulares formadas por vírus e clamídias; Trofozoítos de Pneumocystis jirovecii; algumas bactérias intracelulares

5. Cite alguns cuidados, a serem tomados para a execução satisfatória da coloração simples.

R: Para que a coloração seja apresentada corretamente, deve-se cumprir as etapas de preparação com veemência, atentando-se para o manejo correto do esfregaço, que deve estar fixado e coberto com a solução corante por aproximadamente cinco minutos, após o qual a lâmina é lavada com água e devidamente seca. As células geralmente se coram uniformemente. Usar um dos corantes: Cristal violeta, azul de metileno, safranina. Atentar-se para o uso de máscara, luva e touca para não contaminar o material biológico.